1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。
2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。
5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。
6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。
商品描述：
產品名稱 | 人原代椎間盤纖維環(huán)細胞專用培養(yǎng)基 | 規(guī)格 | 100mL/500mL |
用途 | 僅供科研研究實驗 | 貨號 | EY-XP4948 |
人原代椎間盤纖維環(huán)細胞專用培養(yǎng)基由團隊精心優(yōu)化，經(jīng)過長期測試，本產品可保持人原代椎間盤纖維環(huán)細胞良好的生長狀態(tài)。
本產品中已包含人原代椎間盤纖維環(huán)細胞胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于人原代椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)。
產品主要成分
名稱 | 體積 | 濃度 | 保存條件 |
原代軟骨細胞基礎培養(yǎng)基 | 500mL | 1× | 4℃、避光 |
原代軟骨細胞培養(yǎng)添加劑 | 5mL | 100× | -20℃、避光 |
胎牛血清（FBS） | 25mL | 終濃度5% | -20℃、避光 |
雙抗（青霉su/鏈霉su，P/S） | 5mL | 100× | -20℃、避光 |
運輸和保存
運輸：放置于含有生物冰袋的保溫箱中低溫運輸
保存方法：按照對應保存條件保存12個月，配置好的培養(yǎng)基2℃～8℃,保存2個月；
質量控制
檢測項目 | 質量控制 |
澄清度 | 澄清 |
PH | 7.3±0.2 |
內毒素含量 (EU/mL) | ≤10 |
無菌檢測 | 細菌 | 陰性 |
真菌 | 陰性 |
支原體 | 陰性 |
細胞生長試驗 | 細胞形態(tài) | 正常 |
細胞生長實驗 | 合格 |
注意事項：
僅限科研用。
培養(yǎng)體系中的一些組分是對人體健康有害的物質，請不要用暴露的皮膚接觸培養(yǎng)體系的液體和有培養(yǎng)體系的液體殘留的容器內部；這部分有害物質的濃度和危害性都較低，如有接觸，立即用自來水沖洗即可。
細胞培養(yǎng)步驟：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1） 準備DMEM-H培養(yǎng)基(添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；胎牛血清，10%。也可根據(jù)實驗需要選擇懸浮培養(yǎng)基，使293T細胞懸浮生長。
2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二． 細胞處理：
1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。
冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
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